58) Задачи и методология генетической инженерии. Методы выде

Дата: Понедельник, 2012-01-16, 5:47 PM | Сообщение # 1

СОЗДАЁТ ГРУППУ

Группа: КРУТЫЕ АДМИНЫ

Сообщений: 407

Репутация: 0

Статус: Offline

С начала 1970-х гг., когда появилась первая публикация о получении in vitro рекомбинантной ДНК, возникла новая наука — генная инженерия. Ее основные направления — создание трансгенных животных и растений и разработка принципов генной терапии. Генетическая инженерия - это комплекс молекулярно-генетических или клеточных методов, которые позволяют создавать нужные (для эксперимента или производства) генетические программы избранных организмов. В том случае, когда манипуляции идут на уровне отдельных генов или на их частях, говорят о генной инженерии. В зависимости от задач можно указать на следующие уровни приложения методов биотехнологического и общего генетико-инженерного: 1) молекулярный, когда дело касается отдельных частей генов; 2) генный; 3) хромосомный; 4) уровень плазмид; 5) клеточный; 6) тканевый; 7) организменный и 8) популяционный.
В задачу генетической инженерии входит решение трех основных задач: 1) конструирование функционально активных генетических структур в виде рекомбинантных ДНК, пригодных для переноса в другие клетки; 2) разработка методов введения рекомбинантных ДНК в клетку; 3) создание условий для нормальной экспрессии генов, введенных в данную клетку. Организмы, полученные в результате внедрения чужеродного генетического материала, называют трансгенными. Технологии, возникшие на основе методов молекулярной генетики, используются в самых разнообразных областях, таких как диагностика наследственных заболеваний у человека и животных, криминалистика и этнография, производство хозяйственно ценных и биологически активных веществ, получение штаммов микроорганизмов, трансгенных животных и растений с заданными свойствами, клонирование целых организмов, органов или отдельных клеток.
Генетическая инженерия на клеточном, хромосомном уровнях и при помощи суммарной ДНК обеспечивает неконтролируемый во время переноса переход генов от одной клетки к другой. Методы генной инженерии отличаются тем, что они обеспечивают контролируемое внедрение индивидуальных избранных генов. Эти методы основываются на возможностях выделения отдельных генов и затем их внедрения в клетку реципиента, в первую очередь с помощью гибридных молекул — векторов.Имеется ряд способов выделения генов. Среди них основными являются: 1) ферментативный синтез генов; 2) химический синтез генов; 3) выделение генов с помощью ферментов рестрикции. 1. Ферментативный синтез гена. В пробирке происходит транскрибирование нити ДНК на молекулах иРНК от данного индивидуального гена, который выделяется из клетки. При наличии фермента обратной транскриптазы происходит транскрибирование молекул ДНК с матриц молекул иРНК. Синтезированные гены, полученные с помощью обратной транскриптазы, не имеют в своем составе регуляторных частей (промотора и др.) и не содержат модифицированных оснований, в результате чего они функционально неактивны. Поэтому желательно иметь матрицы РНК не только со структурными, но и с регуляторными частями генов в виде так называемой про-мРНК. 2. Химический синтез генов. Химический синтез гена впервые осуществил в 1970 г. Гобинд Хорана (США). В лаборатории этого ученого удалось химическим путем связать 77 дезоксирибонуклеотидов в цепочку ДНК, комплементарную к аланиновой транспортной РНК (г-РНК) пекарских дрожжей. Отрезки цепочки соединялись встык с помощью фермента лигазы. Две синтезированные нити соединялись химическими связями в спирализованную двутяжевую структуру. Такой искусственно созданный биополимер и стал геном аланиновой т-РНК, содержащейся в геноме дрожжей. Химический синтез гена технически очень труден и требует знания его нуклеотидной структуры. 3. Выделение генов с помощью ферментов рестрикции. Выделение фрагментов ДНК в хромосомах, несущих гены с необхо¬димыми свойствами, производят с помощью вырабатываемых клетками бактерий ферментов рестрикции (рестриктаз). В клетках кишечной палочки и других бак¬терий были обнаружены ферменты, разрезающие на куски ДНК вирусов и других фагов (там где расположены специфические последовательности нуклеотидов), и тем самым защищающие клетку от разрушения. Рестриктазы распознают в ДНК специфичные для них участки длиной в 4-6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или с некоторым смещением. В первом случае образуются обрывки с ровными (тупы¬ми) концами, во втором - стороны оборванных цепочек ДНК чуть-чуть заходят одна за другую. Такие концы называются липкими, они могут слипаться между собой в силу комплиментарности. Две совершенно не схожие между собой последовательности ДНК (например, слона и лягушки) образуют одинаковые липкие концы, если эти ДНК обработать одной и той же рестрикта¬зой. В настоящее время известно более 500 рестриктаз, способных рубить ДНК в 120 различных последовательностях. Это дало возможность получать фрагменты ДНК, содержащие желаемые гены. При наличии выделенного гена его надо доставить в клетку, наследственность которой предстоит изменить. Основным способом такой доставки служит использование рекомбинантных молекул ДНК плазмид. Рекомбинантными, или гибридными, плазмидами называют их искусственные формы, сочетающие или гены от разных плазмид, или плазмиды, несущие гены, выделенные из хромосом прокариот или эукариот. Рекомбинантная плазмида с включенным в нее участком чужеродной ДНК становится «плазмидным вектором». Введение в клетку и последующее размножение рекомбинантной плазмиды обеспечивают клонирование приобретенного ею чужеродного фрагмента ДНК. В качестве векторов используется ряд природных плазмид, а также векторы, искусственно сконструированные с помощью рестриктаз и лигаз. Скрепить липкие концы помогает ДНК-лигаза, сшивающая фосфодиэфирные связи.