| EvGaDeAd | Дата: Четверг, 2012-01-12, 1:11 AM | Сообщение # 1 |
|
СОЗДАЁТ ГРУППУ
Группа: КРУТЫЕ АДМИНЫ
Сообщений: 407
Статус: Offline
| . . Культивирование и идентификация вирусов - основные вирусологические методы, используемые в практической вирусологии при диагностике вирусных заболеваний. Материал, в котором подозревается наличие вируса, например лизат бактерий, кусочек ткани или биологическая жидкость, при необходимости измельчают или гомогенезируют с тем, чтобы при контролируемых условиях перевести его в суспензированное состояние.
Большие фрагменты клеток, а также возможные загрязняющие материал микроорганизмы удаляют при помощи центрифугирования и фильтрования. Такую очищенную суспензию вводят подходящему хозяину, либо добавляют к суспензии клеток, либо наносят на монослой соответствующих клеток. В результате в слое чувствительных клеток, таких, как бактерии, растущие в чашке с агаром, или клетки животных, растущие на поверхности стекла, могут появиться локальные поражения, так называемые бляшки, которые характерны для данного вируса.. Бляшки образуются в результате заражения расположенных в данной области клеток, размножения в них вируса и их полного или частичного лизиса. Если размножение вируса не ведет к образованию визуально выявляемых дискретных бляшек, вирус может быть обнаружен и охарактеризован по изменениям, вызываемым им в культуре клеток, или по повреждению слоя клеток либо при помощи других тестов.
Если исследуемый материал не наносят на слой культивируемых клеток, а вводят в организм хозяина, то цель эксперимента - выявление общих реакций организма, свидетельствующих о развитии инфекции: появление симптомов заболевания, гибель животного или какие-либо иные специфические реакции, например образование антител. Наконец, если ни заражение культуры клеток, ни введение материала в организм хозяина не ведут к появлению каких-либо симптомов вирусной инфекции, вирусологи прибегают к так называемым «слепым пассажам», т.е. к повторным переносам исследуемого материала, что часто приводит к повышению вирулентности вируса или к увеличению его титра.
Правила работы с вирусным материалом
1. Работу с вирусами и культурами клеток проводят в специальных помещениях, обеспечивающих достаточную стерильность.
2. Рабочее место должно быть перед работой продезинфицировано, а используемые материалы и посуда - стерильными.
3. Всегда работать в халате, руки хорошо вымыть с мылом, протереть ватным тампоном, смоченным спиртом. Если необходимо, надеть перчатки и их также обработать дезинфицирующим раствором, вы¬тереть стерильным полотенцем и обработать спиртом.
4. Волосы закрывать косынкой или шапочкой! Голову не наклонять над рабочей зоной.
5. Когда проводятся работы, в помещение запрещается входить, осо¬бенно посторонним людям, не знакомым со спецификой работы.
6. Горлышки сосудов нужно обжигать со всех сторон, перед тем как вынуть пробку. Открывать сосуды только около огня. Открытые со¬суды держать у огня в наклонном положении.
7. Жидкость в пипетки никогда не набирать ртом! Только пипеткой с грушей или ручным дозатором.
8. Если инструментами в процессе работы пользуются несколько раз, то их помещают в спирт и прожигают в пламени спиртовки или го¬релки перед повторным использованием.
9. Отработанные пипетки должны быть помещены в банку с дезинфи-цирующим раствором, после работы промыть их водой и погрузить в хромовую смесь.
10. После работы стол и полы в комнате моют дезинфицирующим рас-твором.
11. Все флаконы с остатками сред и солевых растворов, но не загряз¬ненные вирусами, ополаскивают водопроводной водой и сдают на основную мойку.
12. Всю посуду, резиновые пробки, содержащие вирус, собирают в отдельный контейнер, заливают водой и кипятят не менее получаса перед тем, как сдать на мойку. Вместо кипячения зараженную посу¬ду можно выдержать в течение суток в дезинфицирующем раство¬ре. Ватно-марлевые пробки из пробирок и склянок, содержащих ви¬рус, перед повторным использованием стерилизуют сухим жаром.
Методы культивирования вирусов
1. Культуры клеток.
2. Куриные эмбрионы.
3. Лабораторные животные.
Культуры клеток готовят из тканей животных или человека и раз¬деляют их на:
1) первичные или неперевиваемые;
2) полуперевиваемые;
3) перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток состоит из этапов:
1) измельчение ткани;
2) разъединение клеток путем трипсинизации;
3) отмывание однородной суспензии изолированных клеток от трипсина;
4) суспендирование клеток в питательной среде, которая обеспечи¬вает их рост;
5) перенос питательной среды и изолированных клеток ткани в спе¬циальные сосуды для культивирования.
Клетки начинают развиваться и в дальнейшем приклеиваются к стенкам сосуда, образуя слой на поверхности стекла. Такую культуру также называют однослойной культурой клеток.
После образования сплошного монослоя культура клеток может быть использована для дальнейшего пассирования. При повторном пе ресеве старую среду удаляют, клетки снимают со стекла трипсином, суспендируют в свежей питательной среде и рассевают в новые сте¬рильные флаконы. Полученная таким образом культура носит название вторичная или полуперевиваемая культура клеток С помощью спе¬циальных методик культивирования получают штаммы диплоидной культуры, клетки которой сохраняют диплоидный набор хромосом на протяжении 50 пассажей. Такая культура называется полуперевиваемой диплоидной, или полуперевиваемой. Непосредственно к такой культуре относятся диплоидные клетки человека.
Иногда, в процессе пассирования диплоидная клетка может трансформироваться и дать начало линии клеток, обладающих гетероп-лоидным набором хромосом и способных к неограниченному размно¬жению в культуре, - так появляются перевиваемые культуры. К пере¬виваемым культурам относятся злокачественные линии клеток человека и животных.
Развивающийся куриный эмбрион - наиболее простой и широко используемый объект для культивирования вирусов животных. Эмбри¬он используют на 10-12 день развития. В это время аллангоисная по¬лость куриного эмбриона содержит 5-10 мл жидкости. Наиболее про¬стым способом внесения вируссодержащего материала является зара¬жение в названную полость, оно будет более подробно рассмотрено ни¬же. Для разных вирусов иногда приемлемы другие пути заражения ку¬риного эмбриона: в полость амниона, в хорионаллантоисную полость, желточный мешок.
Перед заражением скорлупу яйца над воздушной камерой обра¬батывают спиртом, обжигают на пламени, смазывают 2 % раствором йода, вторично протирают спиртом и обжигают. Границы воздушной камеры заранее обводят маркером при просвечивании. Над воздушной камерой в скорлупе проделывают небольшое отверстие с помощью ножниц, скальпеля или же специального буравчика.
Шприцем вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала в ал-лантоисную полость (на 2-Змм ниже точных границ воздушной каме¬ры). Отверстие в скорлупе заливают парафином. Вскрытие эмбриона проводят через 48-72часа при инкубации 37 С. Сначала скорлупу со стороны отверстия протирают спиртом и 2 % раствором йода, скорлупу рассекают ножницами, осторожно ее снимают, чтобы парафин и сама скорлупа не попали внутрь. Снимают подскорлупную оболочку и рас¬сматривают хорионаллантоисную оболочку вокруг места заражения, отмечая наличие или отсутствие очагов поражения. С помощью пасте¬ровской пипетки прокалывают хорионаллантоисную оболочку в участке, свободном от сосудов, и отбирают аллантоисную жидкость. Извле¬ченную жидкость используют для проведения реакции ГА.
Хорионаллантоисную оболочку дважды промывают раствором хлорида натрия, помещают в чашку Петри и отмечают на черном фоне наличие специфических поражений.
К недостаткам этого способа культивирования вирусов относят¬ся: невозможность обнаружения исследуемого вируса без вскрытия эм¬бриона, а также наличия в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку вирусов при изго¬товлении различных препаратов.
Лабораторных животных для культивирования вирусов ис¬пользуют в тех случаях, когда вирус плохо репродуцируется в культуре клеток или в эмбрионе. Но заражение организма лабораторного живот¬ного - крысы, хомячка, морской свинки, кролика, мыши - посторонни¬ми вирусами ведет к уничтожению животного. И для получения чистой линии данного вируса все же необходимо использовать культуры кле¬ток.
Методы индикации вирусов
Для индикации или обнаружения вирусов используют:
1. Цитопатическое действие вирусов (ЦПД).
2. Метод негативных колоний.
3. Реакция гемадсорбции (ГА).
4. Реакция гемагглютинации (РГА).
После получения монослоя жизнеспособных культур клеток их заражают материалом, который содержит вирусы. Цитопатическое действие (ЦПД) характеризуется морфологическими изменениями кле¬ток. Часть из таких клеток погибает и отслаивается от стенок пробирки. Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие, которые через некоторое время также погибают. В результате вместо сплошного монослоя клеток остаются лишь отдель¬ные клеточные островки, которые обнаруживаются микроскопически. Характер ЦПД, вызванного разными вирусами, неодинаков. Например, при поражении парамиксовирусами, герпесвирусами наблюдается слия¬ние клеток с образованием синцития, при энтеровирусах, реовирусах — сморщивание и деструкция клеток, при аденовирусах - гроздевидная агрегация клеток, при поражении вирусом кори - симпластобразование. То есть характер ЦПД используют для ориентировочной идентифика¬ции.
Определение вирусных частиц методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают 10-кратными разведениями вируса. После 6-7 дней инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, кото¬рое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз (ЦПД 50) в 1 мл препарата.
ЦПД, кроме микроскопирования, может быть обнаружено мето¬дом негативных колоний, или методом бляшек. Суть этого метода заключается в следующем: монослой клеток после удаления питатель¬ной среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем агара с индикатором нейтральным красным. Агар в этом случае исполь¬зуют для того, чтобы ограничить распространение вируса по клеточно¬му слою. Инкубируют при 37°С и через 48-96 часов выявляют пятна бляшки, или негативные колонии. Живые клетки накапливают краску, погибшие ее теряют, поэтому участки клеточного монослоя, повреж¬денные вирусом, выглядят светлыми на фоне окрашенных клеток. Обычно бляшки имеют диаметр 1-3 мм. Пятна возникают за счет ЦПД вируса.
Наиболее точным количественным методом учета вирусных частиц является метод бляшек. Зависимость между числом образо¬вавшихся бляшек и числом инфекционных вирусных частиц в препара¬те строго линейна, и, следовательно, каждая негативная колония соот¬ветствует одной инфекционной единице. Конечный результат титрова¬ния, или титр вируса, выражается количеством бляшкообразующих единиц - ВОЕ.
Титр рассчитывают: Титр вируса (БОЕ/мл) = а/0,2*разведение, где
а - среднее число бляшек для данного разведения.
Для индикации вирусов используют реакции гемадсорбции и гемагглютинации.
Реакция гемадсорбции (ГА) - это способность вирусов адсорби¬ровать эритроциты на поверхности клеток, в которых они репродуцируются. Для постановки ГА в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов. Через 40-60 мин. клетки промывают раствором хлорида натрия. На поверхности клеток, пораженных виру¬сами, остаются прилипшие эритроциты, а те клетки, которые не пора¬жены, остаются «чистыми», то есть без эритроцитов на своей поверхно¬сти.
Реакция гемагглютинации (РГА) — способность вирусов осаж¬дать эритроциты с образованием глыб; при этом происходит скучивание эритроцитов. РГА способны вызывать вирусы, содержащие в своей обо¬лочке гемагглютинин.
Для постановки РГА используют пластмассовые пластинки с лункой. В лунках готовят серию разведений вируса. К каждому разве¬дению в лунке добавляют по 0,5 мл 1% суспензии эритроцитов кур. В тех лунках, где титр, или количество вируса, достаточен для полной агглютинации добавленных эритроцитов, наблюдается их осаждение: дно лунки равномерно покрыто розовой пленкой - агглютинировавши¬ми эритроцитами. Для появления реакции требуется не менее 10-10 вирусных частиц в 1 мл. В отсутствие вируса эритроциты оседают на дно в виде компактного осадка («пуговицы»).
Записываются результаты проведенной РГА по схеме:
+ + + + выраженная или полная гемагглютинация; тонкая пленка склеившихся эритроцитов на дне пробирки, имеющая вид зонтика;
+ + + наличие небольших просветов в пленке;
+ + наличие пленки с фестончатым краем из склеившихся эритро¬цитов;
+ хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинировавших эритроцитов;
- резко очерченный осадок, не отличимый от контроля, вид «пуговицы». РГА также используют для количественного определения вирус-ных частиц. Конечной точкой титрования считается такое разведение вируса, при котором наблюдается агглютинация половины добавленных эритроцитов. Количество гемагглютинировавших частиц, внесенных в эту лунку, принимают за единицу. Титром вируса в РГА считают число единиц гемагглютинации в 1 мл исходного препарата:
Титр вируса (един. РГА / мл) =-1/0,5 х разведение.
|
| |
|
|
