| EvGaDeAd | Дата: Понедельник, 2012-01-16, 5:46 PM | Сообщение # 1 |
|
СОЗДАЁТ ГРУППУ
Группа: КРУТЫЕ АДМИНЫ
Сообщений: 407
Статус: Offline
| Понятие о векторах. Векторы на основе плазмид и ДНК фагов. При наличии выделенного гена его надо доставить в клетку, наследственность которой предстоит изменить. Основным способом такой доставки служит использование рекомбинантных молекул ДНК плазмид. Рекомбинантными, или гибридными, плазмидами называют их искусственные формы, сочетающие или гены от разных плазмид, или плазмиды, несущие гены, выделенные из хромосом прокариот или эукариот. Введение в клетку и последующее размножение рекомбинантной плазмиды обеспечивают клонирование приобретенного ею чужеродного фрагмента ДНК. В клетки млекопитающих внедряется онкогенный обезьяний вирус SV40, его используют для внесения в эти клетки чужеродной ДНК. Кроме того, этот вирус способен давать псевдовирионы, которые в своей белковой оболочке (капсиде) несут не геном вируса, а фрагмент ДНК той клетки, в которой происходило образование псевдовириона. В 1980 г. ген инсулина человека, введенный в клетки бактерий, кодировал в них синтез человеческого инсулина. Этот инсулин прошел испытания на людях и оказался очень эффективным. Инсулин, который в клетках бактерий кодировался человеческим геном, не вызывает побочных явлений, что свойственно инсулину, получаемому из поджелудочных желез свиней. В 1980 г. через плазмиду pBR322 в клетку кишечной палочки С. Нагата и сотрудники, а также Д. Гёддель и сотрудники ввели ген лейкоцитарного интерферона. В 1981 г. Т. Танигучи и сотрудники ввели в Е. coli ген фибробластного и в 1982 г. П. Грей и сотрудники - ген иммунного интерферона. Были получены линии бактерий, продуцирующие интерферон. Для интерферона типа а-F его продукция была получена в клетках Е. coli. Эта задача в 1982 г. была решена Ю. А. Овчинниковым и сотрудниками. Трансформация — процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. Иногда под трансформацией понимают любые процессы горизонтального переноса генов, в том числе трансдукцию, конъюгацию и т. д. Транспортировка функциональных генов в ткани может сделать возможной коррекцию генной недостаточности и мутаций, следствием которых являются тяжелые наследственные патологии или раковые опухоли. В настоящее время разработан целый ряд приемов для введения ДНК в клетки, среди которых наиболее распространены преципитация фосфатом кальция или диэтиламиноэтил-декстраном (ДЕАЕ-декстраном), электропорация, микроинъекция, встраивание ДНК в реконструированную оболочку вирусов или липосомы (искусственные мембранные липидные везикулы). В качестве переносчиков ДНК используются ретровирусные векторы, векторы на основе ДНК-содержащих вирусов и ВИЧ, липосомы на основе катионных липидов, полимерные ДНК-связывающие катионы. Использование синтетических полимеров в качестве переносчиков ДНК имеет ряд преимуществ: удобство хранения и очистки, простота тестирования токсичности и безопасности и, что особенно важно для генной терапии, снижение риска патогенетических и иммунологических осложнений. Перенос генов в клетки других организмов. Известны многочисленные методы, с помощью которых можно внедрить чужеродную ДНК в геном того или иного организма. В качестве реципиентов, в геном которых встраиваются чужеродные гены, используют клетки культуры, эмбриональные клетки млекопитающих, некоторых растений, дрозофилы, пронуклеусы млекопитающих, у растений - протопласты, изолированные клетки и ткани, микроспоры, незрелые зиготические зародыши. Микроинъекция. С помощью тонких стеклянных микропипеток (диаметром 0,1 — 0,5 мкм) и микроманипулятора можно ввести в ядро клетки млекопитающих векторную ДНК с включенным в нее трансгеном. Эффективность (частота интеграции трансгена в геном) такой трансформации достигает 50 %, т. е. в 50 из 100 инъецированных клеток происходит трансформация. Число молекул ДНК, вводимых за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300 000. Для микроинъекций в клетки растений используются микроиглы с наружным диаметром 2 мкм. Трансформация растительных клеток происходит с эффективностью 10 — 20% независимо от типа вектора.
Электропорация. Метод основан на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. На растительные протопласты (или животные клетки) и находящуюся в окружающей среде ДНК действуют высоковольтным импульсом (200 — 350 В, длительность 54 мс). Через образующиеся на короткое время поры ДНК проникает в клетку. Трансфекции. Это встраивание чужеродной ДНК в культивируемые эукариотические клетки в результате обработки их изолированной ДНК. Эффективного поглощения ДНК удалось достичь при добавлении к ней ионов кальция. Предполагают, что клетки преимущественно поглощают частицы кальциевого преципитата ДНК по механизму фагоцитоза, а затем небольшая часть проникших в клетку молекул встраивается в хромосомную ДНК. Упаковка в липосомы. Это один из методов, используемых для защиты трансформирующего генетического материала от разрушительного действия нуклеаз, присутствующих вне клеток. Липосомы — это сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов и внутри которых располагается трансформирующая ДНК. Липосомы захватываются клетками, и ДНК попадает внутрь. Бомбардирование микрочастицами. Это один из самых эффективных методов трансформации однодольных растений. В качестве исходного материала для трансформации берется суспензионная культура, каллусная ткань или 4 — 5-дневные культивируемые незрелые зародыши однодольных. Для бомбардирования используют частицы золота или вольфрама размером 0,6 — 3 мкм, на которые наносится ДНК вектора, содержащего необходимый для трансформирования трансген. Этими частицами заряжают «генные пушки», после выстрелов из которых частицы, содержащие гены, проникают в клетки и ядра. Клетки в направлении выстрела чаще всего гибнут, в то время как в зоне 0,6-1 см от центра находятся наиболее удачно трансформированные клетки. Частицы могут проникать на глубину 2 — 3 клеточных слоев. Дрожжи как объекты генетической инженерии: Многие данные по цитологии, биохимии и генетике эукариот были впервые получены на дрожжах рода Saccharomyces. Особенно это положение касается биогенеза митохондрий: дрожжи оказались одними из немногих организмов, способных существовать только за счёт гликолиза и не гибнущих в результате мутаций в геноме митохондрий, препятствующем их нормальному развитию. Для генетических исследований важен короткий жизненный цикл дрожжей и возможность быстрого получения большого числа их особей и поколений, что позволяет изучать даже очень редкие явления.
|
| |
|
|
