| EvGaDeAd | Дата: Понедельник, 2012-01-16, 5:59 PM | Сообщение # 1 |
|
СОЗДАЁТ ГРУППУ
Группа: КРУТЫЕ АДМИНЫ
Сообщений: 407
Статус: Offline
| Для передачи дочерним клеткам генетической информации в процессе репликации ДНК должна быть создана копия генома. Репликация ДНК осуществляется ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами. Эти ферменты используют в качестве шаблона одну из цепей двойной спирали ДНК, так называемую матрицу. На матрице, начиная с короткой стартовой последовательности (праймера), ферменты синтезируют комплементарную цепь и воспроизводят в итоге исходную двухтяжевую ДНК. Субстратами ДНК-полимераз являются четыре дезоксирибонуклеотидтрифосфата: аденозин-, гуанозин-, тимидин- и цитозинтрифосфаты. При каждом шаге синтеза ДНК происходит спаривание нуклеотида с соответствующим азотистым основанием матричной цепи. Затем α-фосфатная группа связанного нуклеотида подвергается нуклеофильной атаке со стороны 3'-ОН-группы предыдущего нуклеотида. За этим следует удаление дифосфата и образование новой фосфодиэфирной связи. Эти этапы повторяются снова и снова по мере движения ДНК-полимеразы от одного основания к следующему вдоль матрицы. В соответствии с этим механизмом матричная цепь ДНК считывается в направлении 3'→5'. В большинстве клеток имеется несколько ДНК-полимераз. Наряду с ферментами, которые осуществляют собственно репликацию, существуют полимеразы, которые включены в процессы репарации ДНК (см. с. 252) или реплицируют митохондриальную ДНК эукариот. Большинство ДНК-полимераз построены из множества субъединиц, роль которых до конца не выяснена. Расплетание нитей молекулы ДНК происходит с помощью особого белка – геликазы. Оно идет против витков спирали и совершается с огромной скоростью. При расплетании возникает суперспирализация и вращение ДНК, которое снимается группой ферментов, называемых топоизомеразами. Топоизомераза I – вносит временный одноцепочечный разрыв перед репликативной вилкой, что позволяет спирали ДНК вращаться вокруг своей оси. После снятия напряжения разорванная цепь восстанавливается. Топоизомераза II – создает временный двуцепочечный разрыв, удерживая вместе оторванные друг от друга концы цепей. Присутствие этого фермента позволяет распутывать сложные переплетения и узлы. Затем на релаксированный участок родительской молекулы ДНК, с которого начинается репликация и который называется точной начала (или ориджином) репликации (ori C) садятся инициаторные белки. Синтез цепи ДНК всегда идет в направлении 5’→ 3’. Из-за того, что в родительской молекуле ДНК цепи антипараллельны, на одной из родительских цепей новая цепь синтезируется непрерывно в направлении 5’→ 3’, что совпадает с движением репликативной вилки. Это лидирующая (или ведущая) цепь. Другая растет за счет синтеза коротких фрагментов также от 5’к 3’, но они синтезируются в обратном направлении и носят название фрагментов Оказаки. На ДНК- матрице ДНК – праймаза синтезирует короткую РНК – затравку (праймер). Затем РНК – праймеры удлиняются действием ДНК – полимеразы III. На матрице отстающей цепи собираются SSB – белки, удерживая цепь в выпрямленном состоянии, затем синтезируются РНК – праймеры, которые удлиняются действием ДНК – полимеразы III, которая при этом вытесняет SSB – белки по мере синтеза нового фрагмента Оказаки. Фрагметны Оказаки сшиваются благодаря действию двух ферментов: ДНК–полимеразы I, продолжающей синтез в направлении 5’→ 3’, одновременно удаляя РНК – праймер, и ДНК – лигазы, достраивающей одноцепочечную брешь. Репликация осуществляются дискретно. Участок ДНК, в котором происходит индивидуальный акт репликации, называется репликоном. Репликон содержит все регуляторные элементы, необходимые для репликации: ориджин и может иметь терминатор. Геном прокариот составляет единственный репликон. Полигенный контроль реплиации. Б. Альбертс и А. Корнберг высказали в начале 70-х годов предположение о том, что редупликацию ДНК осуществляет комплекс белков - реплисома, аналогичный рибосоме. По-видимому, кроме ДНК-полимераз и уже перечисленных факторов в состав реплисомы, формирующейся в репликационной вилке, входят и другие белки, прямо или косвенно участвующие в синтезе ДНК. В реплисому, по-видимому, включаются продукты генов dnaB и dnaC, необходимые в течение всей редупликации. Продукт гена dnaB Е. coli оказался ферментом, катализирующим ДНК-зависимый гидролиз рибонуклеозидтрифосфатов до рибонуклеозиддифосфатов и фосфата. Эту активность примерно в 20 раз стимулирует добавление молекул ДНК. Роль продукта dnaB в редупликации пока не установлена. Продукт dnaG необходим для инициации синтеза новых фрагментов Оказаки. Существенным компонентом реплисомы может быть также белок, связывающий ДНК, который обнаружен у ряда объектов - прокариот и эукариот. Белок стимулирует редупликацию и рекомбинацию. Видимо, в ходе редупликации он облегчает разделение комплементарных цепей ДНК. Компонентами реплисомы являются также ферменты, названные топоизомеразами. Их функция — изменение степени суперспирализации ДНК и последующего соединения разорванных концов. Наконец, найдено несколько ферментов, которые плавят ДНК (разделяют комплементарные цепи) за счет использования энергии гидролиза АТФ, например продукт гена rep Е. coli. Итак, в репликационной вилке происходит множество событий: раскручивание ДНК, разделение ее комплементарных цепей, синтез затравочного фрагмента РНК с последующим образованием фрагмента Оказаки, удаление РНК-затравки, заполнение образовавшегося односпирального пробела и ковалентное соединение фрагментов Оказаки. Рестрикция и модификация ДНК (от позднелат. restrictio-ограничение и modificatio- видоизменение), специфич. р-ции метаболизма ДНК в клетках бактерий, обеспечивающие защиту собственной ДНК от встраивания в нее последовательностей ДНК чужеродного происхождения. Функционирование систем Р. и м. ДНК (сокращенно Р.) основано на след. принципах. С помощью ферментативных р-ций собств. клеточная ДНК специфич. образом модифицируется так, что рестриктазы оказываются по отношению к этой ДНК неактивными. Любая вторгающаяся в клетку чужеродная ДНК отличается от резидентной (собственной) ДНК по специфичности модификации. Это делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестриктаз; разрушению ("рестрикции") подвергаются те молекулы ДНК, к-рые не содержат соответствующих модифицир. элементов. Таким образом., благодаря системе Р. возможность функционирования чужеродной ДНК в клетке и ее рекомбинации с собств. клеточной ДНК (см. Рекомбинация генетическая)сведены к минимуму. Известно неск. бактериальных систем Р. Наиб. хорошо изучены аллельные системы К и В (разл. структурные состояния гена), определяющие специфичность резидентной ДНК у штаммов Escherichia coli (E. coli), а также неаллель-ные системы RI и RII, генетич. информацию для к-рых несут плазмиды. Подобные системы в клетках животных пока не обнаружены. В большинстве систем модификация осуществляется метилированием N6-аминогруппы остатков аденина в составе тех или иных специфич. участков ДНК с образованием 6-метиламинопурина. Возможны и др. варианты хим. модификации ДНК, осуществляемой компонентами подобных систем. Напр., в системе EcoRII метилируется атом С-5 остатков цитозина, а при контролируемой клеткой-хозяином модификации ДНК Т-четных фагов (инфицируют Е. coli) происходит глюкозилирование остатков гидроксиме-тилцитозина, присутствующего в ДНК этих фагов. Ф-ции рестрикции обусловлены эндонуклеазной активностью рестриктаз, к-рые узнают специфич. последовательности ДНК при условии, что эти последовательности не модифицированы. Фермент катализирует разрыв фосфодиэфирной связи в каждой из двух цепей ДНК вблизи этой последовательности или в др. местах молекулы, что определяется типом фермента. Двухцепочечные разрывы стимулируют дальнейшее интенсивное неспецифич. разрушение ДНК др. нуклеазами. Р. осуществляются только в отношении двухцепочечных молекул ДНК. Одноцепочечные ДНК нек-рых фагов модифицируются или подвергаются рестрикции только тогда, когда они находятся в фазе репликации. В то же время для обеспечения устойчивости к рестриктазам достаточно модификации только одной из цепей ДНК. По этой причине ДНК; образующаяся в ходе полуконсервативной репликации, защищена от действия собств. клеточных рестриктаз благодаря модификации матричной цепи. В. Арбер доказал, что в бактериях действуют специальные ферменты, способные специфично отличать свою ДНК от чужой. Эти ферменты рестрицируют (т.е. ограничивают) возможность размножения фаговой ДНК в бактериях путем ее более или менее специфичной деградации. Такие ферменты были названы эндонуклеазами рестрикции или рестриктазами. Естественной функцией рестриктаз является защита бактерии от инфекции вирусами. ДНК в сайтах рестрикции у самой бактерии модифицирована метилированием, так что фермент рестрикции не может порезать свою собственную ДНК. Однако вирусная ДНК не защищена, и ферменты ее расщепляют .Первая рестриктаза, специфично расщепляющая двухцепочечную ДНК в строго определенных сайтах, была выделена Г. Смитом Известны три класса рестриктаз. В генно-инженерных работах используют ферменты второго класса, разрывающие двухцепочечную ДНК в зоне участка узнавания. Обычно фермент распознает специфичную последовательность из 4-6 п.н., являющуюся палиндромом разрезает ее в середине или несколько в стороне. В последнем случае образуются выступающие одноцепочечные концы, получившие название "липких". Такие концы, сформировавшиеся под действием одной и той же рестриктазы могут гибридизоваться между собой в силу комплементарности оснований. Эта способность обеспечивает возможность объединения различных молекул ДНК. В настоящее время известно более 400 рестриктаз, способных расщеплять ДНК в общей сложности по почти 120 различающимся последовательностям.
|
| |
|
|
